Набор реагентов для цитохимического определения кислой фосфатазы в лейкоцитах
Назначение
Активность кислой фосфатазы выявляется в большинстве гемопоэтических ядросодержащих клеток. Положительная окраска проявляется в плазматических клетках, моноцитах, тромбоцитах, Т-лимфоцитах и особенно бластных клетках при Т-клеточном лимфобластном лейкозе, плазмоцитоме, ВКЛ. Среди клеток миелоидного ряда наибольшая активность КФ выявляется в гранулоцитарных предшественниках, тогда как зрелые гранулоциты отличаются крайне низкой активностью КФ, вплоть до отрицательной реакции. Особое значение имеет определение активности КФ для дифференциальной диагностики острых лейкозов, злокачественных лимфом, миеломной болезни, ВКЛ.
Принцип реакции
Кислая фосфатаза включает ряд изоферментов, обладающих общим свойством- способностью освобождать фосфат из спиртовых или фенольных фосфомоноэфиров в кислой среде. Цитохимическое выявление кислой фосфатазы в световом микроскопе основано на образовании нерастворимого окрашенного преципитата в местах, где происходит гидролиз субстрата, который катализирует кислая фосфатаза.
Реагенты
Набор обеспечивает 12 исследований
Вошедшие в набор:
- Нафтол-AS-фосфат -1фл.
- Диметилформамид -1 фл.
- Ацетат Nа -1 фл.
- Парарозанилин -1 фл.
- Азотистокислый Nа -1 фл.
- Тартрат натрия -1 фл.
Не вошедшие в набор:
1. Фиксирующая смесь (10% спиртовой раствор формалина или 40% формалин)
Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина):
1мл 40% формалина смешивают с 9 мл 96° этилового спирта. Как прозрачный, так и мутный, молокообразный раствор формалина одинаково пригодны. Полученный 10% раствор формалина хранится в холодильнике.
2. Дистиллированная вода;
3. 96º этанол;
4. Краситель «Диахим-ГемиСтейн-ГМ» (гематоксилин Майера-гемалаун).
5. Соляная кислота (конц.,11М, ρ=1,18г/см³)
Приготовление 1н соляной кислоты:
83,3мл соляной кислоты (конц.) поместить в колбу ( вместимостью1000мл) и довести до 1000мл дистиллированной водой, перемешать.
Приготовление рабочего раствора
Приготовление ацетатного буфера.
Содержимое флакона ацетата Nа растворить в колбе (вместимостью 500мл) в 500мл дистиллированной воды, охладить.
А. Отвесить 20 мг нафтола-AS-фосфата и растворить его в 0,5мл диметилформамида, долить 40мл холодного ацетатного буфера. Приготовление 4%раствора азотистокислого Nа. Содержимое флакона с азотистокислым Nа растворить в 10 мл дистиллированной воды.
Б. В отдельной небольшой посуде (пробирке) смешать 8 капель парарозанилина и 8капель 4% раствора азотистокислого Nа.
Рабочий раствор:
Раствор А слить с раствором Б. Тщательно смешать, отфильтровать. Измерить рН с помощью рН-метра ( в соответствии с инструкцией к прибору). рН раствора должен быть 5,2-5,4.
При рН больше 5,4 раствор подкислить несколькими каплями 1н НСl. Профильтровать
Ход реакции
Сухие мазки крови или костного мозга фиксировать в парах формалина во влажной камере.
Для фиксации мазки помещают в чашку Петри на стеклянные палочки так, чтобы мазки не касались лежащей на дне чашки ваты или марли, смоченной 40% формалином. Чашку накрывают крышкой - 30 сек.
Или в 10% спирт - формалиновой смеси.
Сухие мазки крови или костного мозга поместить для фиксации в емкость с 10% раствором формалина на этиловом спирте.
Промыть проточной водой - 60сек.
Хорошо высушить.
Поместить в свежеприготовленный рабочий раствор ( в емкость Хеллендахела, вертикально!, во избежание образования преципитата на стекле).
Инкубировать в темноте при tº 37º. 2-3часа.
Промыть дистиллированной водой и промокнуть фильтровальной бумагой - 10сек
Докрасить ядра гематоксилином Майера.
Поместить препараты в емкость для окраски мазков (Хеллендахела) заполненную гематоксилином Майера и производить окраску в течение - 15мин.
Промыть стекла в проточной воде - 10сек.
Высушить.
Процедура ингибиции реакции КФ тартратом Nа.
При необходимости проведения реакции с тартратом Nа готовится 2 части рабочего раствора. В одной части ведется окраска на выявление активности КФ, в другой выявляется ингибиция реакции тартратом Nа. Во вторую половину добавляют тартрат Nа из расчета 300мг реактива на 40 мл рабочего раствора и инкубируют мазки в этой среде параллельно с инкубацией в свободной от тартрата среде. Тартрат ингибирует реакции в нормальных клетках крови и костного мозга. Патологические клетки при ВКЛ тартратрезистентны.
Примечание:
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезенки, лейкозных инфильтратах разной локализации.
Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.
При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.
Приготовленные мазки не рекомендуется хранить более 24 часов, т. к. активность большинства внутриклеточных ферментов снижается.
Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе.
Нефиксированные мазки могут храниться в темноте в течение 3 недель.
Результаты окраски
Активность кислой фосфатазы выявляется в виде гранул ярко-красного цвета в цитоплазме лимфоцитов и диффузно-гранулярного окрашивания в моноцитах и гранулоцитах. Т-лимфоциты содержат единичные крупные гранулы кислой фосфатазы, в не-Т-лимфоцитах реакция отрицательная, либо мелкогранулярная.