Набор реагентов для цитохимического определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах
Назначение
Определение активности (индекса) щелочной фосфатазы применяется для цитохимической дифференциации хронической миелоидной лейкемии от других заболеваний миелопролиферативного типа.
Принцип реакции
В основе лежит метод азосочетания - расщепление щелочной фосфатазой альфа-нафтилфосфата с освобождением альфа-нафтола, образующего с солями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.
Реагенты
Набор обеспечивает 6 исследований
Вошедшие в набор:
- Альфа-нафтилфосфат натрия - 6 фл
- Прочный синий РР (диазониевая соль 4-бензоил-2,5-метоксианилина) - 6 фл
- 0,2 М пропандиоловый буфер - 1 фл (60мл)
- Метиловый зеленый (сухой краситель) - 1фл
Не вошедшие в набор:
1. Фиксирующая смесь (10% спиртовой раствор формалина)
Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина):
10мл 40% формалина смешивают с 90 мл метилового спирта. Как прозрачный, так и мутный, молокообразный раствор формалина одинаково пригодны. Полученный 10% раствор формалина хранится в холодильнике.
2. Дистиллированная вода;
3. Соляная кислота (конц.,11М, ρ=1,18г/см³)
Приготовление 0,1н соляной кислоты:
83,3мл соляной кислоты (конц.) поместить в колбу ( вместимостью1000мл) и довести до 1000мл дистиллированной водой, перемешать.
4. Хлороформ
Приготовление реагентов
Приготовление 0,05 М буферного раствора
К содержимому флакона маточного раствора пропандиолового буфера добавить 70мл дистиллированной воды (проверить рН 9,6 - 9,7), при необходимости добавить 3,5 мл 0,1н соляной кислоты. Хранить в холодильнике.
Приготовление 2% раствора метилового зеленого
Содержимое флакона метилового зеленого растворить в 100 мл дистиллированной воды и вылить в делительную воронку. В ту же воронку залить 50 мл хлороформа. Смесь взболтать несколько раз в течение дня и оставить на ночь для экстрагирования метилового фиолетового. Краска «метиловый зеленый нестойка, под влиянием света и кислорода воздуха часть метилового зеленого превращается в метиловый фиолетовый, который должен быть экстрагирован хлороформом и удален.
Рабочий раствор
Содержимое флакона с альфа-нафтилфосфатом натрия растворить в 5мл 0,05М буферного раствора и добавить содержимое флакона прочного синего РР. Хорошо перемешать. Готовится перед употреблением и фильтруется прямо на стекла. Рабочий раствор стабилен в течение 15 минут. Раствор имеет красно-коричневый цвет и быстро становится мутным, но мутность не влияет на окраску.
Ход реакции
- Погружение высушенных на воздухе мазков крови или костного мозга на 30 сек в фиксирующий раствор -10% спиртовой раствор формальдегида (из холодильника!).
- Промывание мазков проточной водой в течение 10 сек.
- Инкубация в субстратной смеси 10 мин при комнатной температуре. Промывание проточной водой 10 мин.
- Докраска 2% раствором метилового зеленого в течение 15 мин.
Примечание
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезенки, лейкозных инфильтратах разной локализации.
Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.
При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.
Использовать только хорошо высушенные препараты!
Зафиксированные мазки могут храниться в темноте, при комнатной температуре.
Результаты окраски
Коричневый продукт реакции проявляется лишь в финальных стадиях созревания гранулоцитов. Оценивается 100 нейтрофилов с сегментоядерным ядром. В случае нейтропении учитывается самое большее 10% палочкоядерных нейтрофилов. Подсчет соответствия степени окраски учитывает следующие 5 степеней активности цвета:
0 - степень: реакция отсутствует;
1 - степень: гомогенное бледнокоричневое окрашивание;
2 - степень: преципитат в виде гранул;
3 - степень: сильная темно-коричневая окраска;
4 - степень: максимально чернеющая, по всей цитоплазме, ядра часто не видны.
Нормальные показатели (по Лецкому В.Б.)- 50%, индекс 0,67.
Сниженный индекс характерен для активной фазы ХМЛ. Лишь гемолитическая и железодефицитная анемии или некоторые вирусные заболевания показывают сравнительно низкий индекс. Нормальные и повышенные цифры требуют идентификации. ХМЛ в ремиссии может продуцировать нормальную или даже повышенную ЩФ.