Набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах
Назначение
РАS - реакция является важным методом для идентификации прежде всего лимфацитарных клеточных элементов. Вместе с реакцией на миелопероксидазу и неспецифическую эстеразу, РАS- реакция является одним из основных цитохимических методов для дифференциальной диагностики острых лейкозов.
Принцип реакции
Механизм РАS- реакции основан на окислении йодной кислотой гликолевых групп, или их амино- или алкиламино- производных до альдегидов. Альдегидные группировки при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета.
Реагенты
Набор обеспечивает 6 исследований (от1 до 10 препаратов).
Вошедшие в набор:
- Йодная кислота;
- Реактив Шиффа.
- Гематоксилин Майера
Не вошедшие в набор:
1. Фиксирующая смесь (10% спиртовой раствор формалина)
Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина):
1мл 40% формалина смешивают с 9 мл 96° этилового спирта. Как прозрачный, так и мутный, молокообразный раствор формалина одинаково пригоден. Полученный 10% раствор формалина хранится в холодильнике.
2. Дистиллированная вода.
Приготовление рабочего раствора
Содержимое флакона с йодной кислотой растворить в 50мл дистиллированной воды (получаем 1% раствор йодной кислоты). Раствор сохраняет свои свойства в течение 3 месяцев в темном месте.
Ход реакции
- Сухие мазки крови или к /мозга фиксировать в 10% спирт - формалиновой смеси - 10 мин.
- Промыть проточной водой - 10 сек.
- Поместить мазки в1 % раствор йодной кислоты - 10 мин.
- Промыть дистиллированной водой и промокнуть фильтровальной бумагой - 10 сек.
- Поместить мазки в реактив Шиффа - 30 мин (с помощью пинцета, осторожно! Реактив слить назад, не загрязнять!) реактив Шиффа хранится в бутылке из темного стекла, плотно закрытой, при температуре 4ºС. За полчаса до употребления - вынуть из холодильника.
- Промыть стекла в проточной воде - 5 мин.
- Докрасить мазки гематоксилином Майера - 15 мин.
- Промыть в проточной воде - 10 сек.
Примечание:
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезенки, лейкозных инфильтратах разной локализации.
Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.
При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.
Приготовленные мазки не рекомендуется хранить более суток, т. к. активность большинства внутриклеточных ферментов снижается .
Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе.
Окраску рекомендуется производитьв емкости для окраски мазков ( хим. стакан, емкости Хеллендахела, емкости Коплина).
Результаты окраски
Нормальные цитохимические показатели
содержания гликогена в лейкоцитах:
- Для нейтрофилов-95-100% при К = 2,09-2,99.
- Для лимфоцитов от 2 до 33% при К = 0,02-0,52.
Гранулы гликогена окрашиваются в красный или вишнево- красный цвет. Ядра лейкоцитов синие или фиолетовые.
В норме гликоген обнаруживается на стадии миелобласта и его содержание в клетках увеличивается по мере их созревания, достигая максимума в палочко- и сегментоядерных нейтрофилах. Гликоген выявляется также в базофилах, эозинофилах, моноцитах, тромбоцитах, и мегакариоцитах. 5- 30% нормальных лимфоцитов содержат гликоген в виде мелких гранул без диффузного фона.
Изменения при патологических состояниях
При диагностике острых миело- и монобластных лейкозов, бластные элементы чаще всего ШИК-отрицательны, или обнаруживают слабодиффузное окрашивание цитоплазмы, иногда с наличием мелких гранул.
В тоже время лимфобласты при ОЛЛ содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне.